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해양선형동물

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해양선형동물 생물다양성 연구
현생하는 동물계(Kingdom Animalia)는 대략 35개의 문(Phylum)으로 구성되어 있다. 전통적인 관점에서 이들 35개 동물 문들의 분류체계는 현생 종의 형태를 비교하거나, 화석 또는 발생학적 특징들을 기준으로 상위 분류군으로 묶어 배열하여 왔다(예: 후구동물, 선구동물, 무체강동물, 의체강동물, 진체강동물 등). 하지만 이런 전통적인 관점에서 세워진 계통 유연 관계는 연구자들마다 형질을 평가하는 데 있어 주관적 판단이 개입되거나 또한 분류에 이용되는 형질의 제한성 때문에 실제 정확한 계통의 추적이 어려운 경우가 많다(Wilmer, 1990).

선형동물문(Phylum Nematoda), 유선형동물문(Phylum Nematomorpha)은 탈피동물군(Ecdysozoa)중 다수의 공유파생형질(예: 종주근, 콜라젠성 큐티클, 교미기의 유사성 등)을 가진다는 점에서 전통적으로 자매군(sister group)으로 인식되어 왔다. 또한 이들은 새예동물, 동문동물, 동갑동물들과 함께 공유파생형질인 “introvert”를 공유한다는 점에서 보다 상위 분류군인 Introverta(선형-유선형-새예-동문-동갑동물)로서 분류되어 왔으나 최근 18S rDNA 염기서열 분석 및 Hox 유전자 분석으로부터 선형-유선형동물이 “Panarthropoda(절지-완보-유조동물)”에 보다 계통이 가깝다는 연구 결과(Garey, 2001; de Rosa et al., 1999)가 발표되어 탈피동물내 선형동물-유선형동물의 계통적 위치가 탈피동물군의 다양성 및 진화 방향을 이해하는 데 중요한 정보를 제공할 것으로 판단된다.

선형동물은 일찍이 발생 유전체학(Developmental Genomics) 및 기능성 유전체학(Functional Genomics) 분야에 있어서 중요하게 인식되어 C. elegans의 경우 이미 유전자의 구조와 기능 해독이 완료되었을 만큼 가시적인 학문적 성과가 이룩된 분류군이다. 이와는 별도로 해양 선형동물은 특히 요각류(copepods), 동문동물, 완보동물, 복모동물과 함께 주요한 해양 간극수 동물중의 하나이며 해양 생태계에서 차지하는 생태적 중요성은 매우 크며 전 지구상의 거의 모든 서식지에서 발견된다.

특히 이들 해양 선형동물은 규조를 포함한 단세포 조류, 박테리아, 원생동물, 선형동물을 포함한 다른 미소한 무척추동물들을 섭식하는 저차 소비자이며, 해양의 저질속에 서식하는 다른 대형 무척추동물(연체동물, 환형동물) 이나 어류 등의 중요한 먹이 공급원으로써 해양 생태계의 먹이사슬에 중요한 연결고리 역할을 담당하고 있다. 이와 같이 해양 선형동물이 해양의 저서생물군집에서 차지하는 역할의 중요성에도 불구하고 미소한 크기, 채집상의 어려움, 표본제작과정 및 조작 등 기술적인 어려움 때문에 현재까지 한국에서는 해양 선형동물에 대한 분류학적 연구가 이루어진 바가 없다.

따라서, 본 연구는 탈피동물의 주 구성원중의 하나인 선형동물을 대상으로 형태분류를 수행하여 아직까지 미개척 분류군으로 남아있는 태평양 연안 해양 선형동물의 생물다양성을 파악하고자 한다.

선형동물은 전 지구상에 현존하는 후생동물(Metazoa)중에서도 개체군이나 종 수에 있어서 가장 다양한 분류군중의 하나로 알려져 있으며, 대부분이 몸 길이 0.15 - 10 mm를 넘지 않는 미소한  크기이고, 이에 반해 기생성의 경우는 최대 8 m에 달하는 실모양의 동물로서, 외부의 형태적인 특징으로 인해 유선형동물(Nematomorpha)과 가장 가까운 유연관계를 보이는 대형동물(Aschelminthes)의 한 구성원으로 알려져 왔다(Brusca and Brusca, 1990, Meglitsch and Schram, 1991 등). 하지만 최근의 18S rRNA 유전자, Hox 유전자 및 ß-thymosin 단백질 등의 분자계통학적인 데이터에 의하면, 전통적인 관점과는 달리 절지동물(Arthropoda), 완보동물(Tardigrada) 및 유조동물(Onychophora)들과 자매군(sister group)을 이루는 무리로서 탈피동물(Superphylum Ecdysozoa)의 한 구성원이라는 견해도 있으며(Aguinaldo et al., 1997; Schmidt-Rhaesa et al., 1998; de Rosa  et al, 1999; Manuel et al., 2000 등), 이와는 달리 또 다른 분자계통학적 데이터인 핵단백질의 정렬(nuclear protein alignmets)에 의하면 선형동물은 기존의 전통적인 견해와 같은 체강동물(coelomate)의 바닥 부위(basal line)에 위치한다는 견해도 보이고 있어서(Blair et al., 2002) 그 계통학적인 위치와 의의에 관해 지금까지도 논란이 많은 분류군 중의 하나이다.

선형동물은 독립적인 門준위의 분류군으로(선형동물 문, Phylum Nematoda) 요각류(copepods), 편형동물(Platyhelminthes), 동문동물(Kinorhyncha), 완보동물(Tardigrada), 복모동물(Gastrotricha)과 함께 주요한 해양 간극수 동물군 중의 하나이다. 지금까지 Adenophorea와 Secernentea의 2강(class)에 걸쳐 20,000여종이 알려져 있으며, 이중 식물에 기생하는 것이 2,000종, 동물에 기생하는 것이 5,000종, 해양, 담수, 토양에서 자유 생활하는 것이 13,000여종이다. 이중 해양 선형동물은 전체 20,000여종 중에서 지금까지 대략 5,000여종이 기록되어 있다. 하지만 최근의 반복적인 생태학적 조사에 의하면 전 지구상에 서식하는 선형동물의 종(species) 수는 대략 40,000에서 100,000,000 종을 추정하고 있으며 이들 추정치의 50%이상을 해양에서 자유생활 하는 선형동물로 예상하고 있다(Dorris et al., 1999). 이러한 추정치는 지금까지 밝혀진 종보다 앞으로 기록해야 할 종들이 무수히 많이 남아 있음을 시사하며 전 지구상의 모든 서식지에서의 선형동물들의 엄청난 다양성을 암시하고 있다.

선형동물에 있어서 가장 높은 다양성(diversity)을 보이는 곳은 단연코 해양이라고 말할 수 있으며(Maggenti, 1982), 위에서 언급한대로 전체 선형동물의 50% 이상이 해양에 서식하고 있다고 예상하고 있다(Dorris et al., 1999). 해양의 선형동물은 조간대와 기수역의 저질,  대륙붕 및 심해의 저질에서도 쉽게 발견되며, 저질에 서식하는 여타 다른 어떤 간극수성 분류군(요각류, 복모류, 동문류, 완보류 등)들 보다 높은 생물량(전체의 50-90%)과 다양성(전체의 90-95%)을 보이며(McIntyre, 1971; Platt and Warwick, 1980; Heip et al., 1982; Higgins and Thiel, 1992; Giere, 1993 등), 또한 해양의 해조류뿐만 아니라 기타 다른 무척추동물(해면동물, 자포동물, 태형동물, 연체동물 등)의 표면에서도 많은 종들이 보고되고 있다(Kito and Hope, 1999). 그러나 위와 같이 해양선형동물이 해양의 저서생물군집에서 중요한 위치를 차지하고 있음에도 불구하고 이들 해양선형동물의 미소한 크기, 채집의 어려움, 표본제작과정 및 조작이 까다롭기 때문에 아직까지 한국에서는 전혀 연구가 이루어지지 않았다.

이들 해양선형동물은 규조를 포함한 단세포 조류, 박테리아, 원생동물, 선형동물을 포함한 다른 미소한 무척추동물들을 섭식하는 저차 소비자이며, 이들 해양선형동물은 해양의 저질속에 서식하는 다른 대형 무척추동물인 조개류나 복족류와 같은 연체동물, 환형동물, 그리고 척추동물인 어류 등의 먹이로서도 없어서 안되는 해양 생태계의 먹이연쇄에서 매우 중요한 연결고리가 되며, 출현 종 수와 서식밀도 및 생물량이 대단히 많다(Bouwman, 1983; Heip et al., 1985; Giere, 1993 등). 이는 조개나 물고기 등의 수산물에 다분히 의존적인 인간의 식생활과도 직?간접적으로 연관이 되어 있음을 시사한다.

해양선형동물에 관한 연구는 1865년 Bastian (1865)에 의해서 여타의 다른 동?식물에 기생하는 선형동물들과 구분되어 연구가 시작되었으며, 1910년까지 불과 29명 정도의 학자(Cobb; De Man; Linstow 등) 에 의해 겨우 475종만이 기록되었다(Gerlach, 1980).

이후 해양 선형동물 연구의 선구자로 불리우는 De Man에 의해 종 수준이나 속 수준의 기재에 있어서 기초가 수립되었으며, 이때 이루어진 자세한 기재와 도판들이 아직도 해양 선형동물 연구에 있어서 중요한 자료들로 인용되어지고 있다. 이어 미국의 “선형동물 연구의 아버지”로 불리우는 Cobb에 의해 해양 선형동물에 대한 연구가 더욱더 활발히 이루어 졌으며, 그의 활발한 연구로 인해 그간의 기생충학(Helminthology)의 의미에서 선충학(Nematology)이라는 용어도 독립적으로 만들어지게 되었다(Croll and Matthews, 1977).

De Man과 Cobb에 의한 기초적인 일들이 바탕이 되어 해양 선형동물 연구에 있어서 연속적인 연구가 성행하게 되었다. 해양 선형동물의 분류체계를 최초로 정립한 사람은 러시아 연구자인 Filipjev (1918, 1921 등)였다. 그는 그때까지 기록된 모든 종들의 형태학적인 형질들을 면밀히 종합, 분석하였으며, 이후 Cobb (1919), Schuurmans Stekhoven 과 De Coninck (1933), Maggenti (1963, 1970), Gadea (1972, 1973), Andrassy (1976)에 이르기까지 새로운 분류체계의 연속적인 수립이 있었고, 가장 최근에 와서 Lorenzen (1981)에 의해 지금의 분류체계가 종합적으로 수립되었다.

이외에도 동아시아 지역을 제외한 전 세계의 각 지역에서 여러 연구자들에 의해서 연구가 활발히 진행되었는데, 그 예로, 북해에서는 Schuurmans Stekhoven (1935), 발틱해는 Schneider (1939), 북미는 Cobb (1920)과 Chitwood (1951), 칠레 연안은 Wieser (1953, 1954, 1956 등), 북미의 동쪽 연안은 Wieser와 Hopper (1967) 등의 연구들이 그 대표적인 사례이다.

해양선형동물의 기초적 기재분류학 연구 외에도 전 세계에 흩어져 있는 방대한 문헌들을 집대성하여 해양선형동물 종들의 총체적인 목록을 만드는 작업도 Stiles and Hassall (1905, 1920 등), Baylis and Daubney (1926), Hope and Murphy (1972) 및 Gerlach and Riemann (1973, 1974 등)에 의해 이루어 졌고, 이중 Gerlach and Riemann (1973, 1974 등)의 총목록집(checklist)은 그 당시까지의 모든 해양 선형동물 종들의 종류상, 분포상 및 동종이명까지 다루는 해양 선형동물 연구에 있어서 가장 괄목상대할 일이었다.

또 한가지 해양선충학 연구에 있어서의 주목해야할 점은 Tarjan (1980)에 의해서 만들어진 그림형식의 검색표(Pictorial Key)였다. 해양 선형동물들은 다분히 상위분류군으로 올라갈수록 이질적인(heterogeneous) 형질 양상을 보이는 분류군이다. 그래서 Tarjan (1980)은 속(genus)수준에서 그 당시까지 밝혀진 분류군에 관하여 그림들로 형질들을 간략히 표현하여, 쉽사리 속 또는 종을 구분할 수 있는 안내서를 발간하였다. Tarjan의 연구에 이어 Platt과 Warwick (1983, 1988 등) 및 Warwick et al. (1998)과 같은 영국의 선형동물 학자들 또한 최근의 모든 해양 선형동물 속들을 망라하여 속 수준의 그림형식의 검색표를 작성하여, 해양 선형동물 연구를 막 시작한 연구자나 생태학자들이 사용하기에 용이하게 하였으며, 영국 연안의 저질 및 해조류에 서식하는 398종의 해양 선형동물들을 기재하였다.

해양선형동물에 관한 분류학적인 연구의 급진적인 발전과 더불어 이들 해양 선형동물에 대한 생태학적 연구들도 다수 수행되었다. Gray and Rieger (1971)는 완전히 노출된 연안과 뻘질성 염습지에 서식하는 해양선형동물의 밀도에 관하여 자세히 관찰, 기술하였고(완전히 노출된 연안의 선형동물의 밀도는 아주 낮으며, 이에 반해 뻘질성의 염습지에서는 아주 높은 밀도상을 보인다),  해양선형동물의 생물량은 해안과 저질의 안정성과 깊은 관계가 있다는 사실을 밝혔다. 연이어 북캐롤라이나의 조간대 모래 해안에서의 조사에서 Ott (1972)는 해양 선형동물의 다양성에 관해서도 면밀히 조사하였으며, Heip et al. (1985)은 좀더 구체적으로 북해에서만 735종의 선형동물이 서식하고 있음을, 그리고 10㎠의 코어(core) 한 개에서 50종 또는 그 이상의 종들이 채집됨을 밝혔다. 그들은 이러한 선형동물의 수적인 풍부함의 결과로 이들 선형동물이 저질 생태계에 있어서 에너지의 흐름(energy flow)에 중요한 역할을 한다는 것을 인지하였다. 또한 Wieser (1951, 1952, 1959 등), Ott (1967), Hopper and Meyers (1967a, 1967b 등), Moore (1971) 및 Warwick (1971)은 해조류에 서식하는 선형동물에도 관심을 기울여, 이들 해조류에 서식하는 선형동물은 저질에서 생활하는 무리들보다 상대적으로 다양성이 빈약함을 기술하였다. 이러한 조간대에 서식하는 해양선형동물에 관한 다수의 연구는 1980년에 와서 Warwick에 의해 총체적으로 집약되게 되었다. 이런 조간대에서의 조사에 힘입어 조하대와 심해에 서식하는 해양 선형동물에 관한 연구도 이루어 졌는데, 조하대나 심해에서 조차도 개체수에 있어서 무려 3,000 ind./㎠에서 42,000 ind./10㎠에 달하였고 생물량에 있어서도 100에서 1,500 ㎍dwt/10㎠에 육박하였다(Soyer, 1971: Lorenzen, 1974; Juario, 1975; Thiel, 1975, 1979; Tietjen, 1976; Dinet, 1979; Dinet and Vivier, 1979 등).

또한 해양선형동물에 대한 분류학적 및 생태학적인 명세가 자세히 밝혀질수록 해양 선형동물들을 이용한 응용적인 연구들도 많이 수행되었는데, 그 대표적인 사례로 해양 선형동물들이 그들이 서식하고 있는 해양 생태계의 오염상태를 잘 대변할 수 있다는 장점들을 이용한 생물지표종(Bioindicator Species)으로의 유익함을 들 수 있다(해양선형동물은 1. 아주 좁은 지역 내에서도 매우 높은 생물다양성을 나타내며, 높은 생물다양성에 비례하여 높은 생물량을 보인다, 2. 해양선형동물들은 짧으면서도 일정한 생식력을 유지하고 있어서 다분히 안정적인 개체군을 유지하고 있으므로 언제라도 조사가 가능하다, 3. 해양선형동물들은 저질 속에서 많은 이동을 하지 않아 그 지역을 대표할 수 있으며, 오염된 지역이라면 그 지역의 선형동물상을 조사함으로 쉽사리 그 지역의 환경상태를 간접적으로 유추할 수 있다, 4. 마지막으로 이들 해양선형동물은 조사가 용이하고 경제적이라는 점이다. 이들 해양선형동물은 그 크기가 미소한 반면, 생물다양성과 생물량이 높아서 작은 양의 표본 조사로도 충분히 객관적인 통계분석을 할 수 있으며, 특히 정량 조사에 용이하다는 점 등이 해양의 저질생태계를 대변할 수 있는 생물지표종으로서의 유용한 면이다). 이러한 생물지표종에 관한 연구는 실용화되고 있어, 이미 외국의 환경영향평가를 전문적으로 시행하는 상업적인 회사에서도 조사 분류군의 하나로 포함시키고 있으며 그 중요성을 인정받고 있다(Bongers, 1990; Lorenzen, 1994; Bongers and Ferris, 1999; Gyedu-Ababio et al., 1999; Nombela et al., 1999; Euler, 2000 등). 해양선형동물들은 그들의 미소한 크기로 인해 종의 구분에 있어서 접근하기가 쉽진 않지만, 몇몇 해양 선형동물의 전문가들에 의하면, 해양 선형동물의 경우는 속(genus) 수준의 분화가 많이 이루어져 있어서 속 수준의 동정으로도 충분히 해양의 생태계를 통계적으로도 잘 대변할 수 있다는 보고도 나와 있으며, 이미 이들을 이용한 정보의 분석기술 문제에 있어서도 많은 결과를 도출해 놓은 상태이다(Clarke and Warwick, 1994; Lorenzen, 1994 등).

현재까지 알려진 해양선형동물의 대부분은 지중해, 인도양, 대서양, 태평양의 북부연안에서 연구된 것으로, 태평양 특히 한국이 위치한 서태평양 쪽에서의 연구는 극히 부진하다. 한편, 일본에서의 해양선형동물의 연구사를 보면, Steiner and Hoppli (1926)가 최초로 4종을 보고한 것을 시작으로 Tokioka (1949), Allgen (1951), Wieser (1955), Kito (1976, 1977, 1981, 1987 등), Sudzuki (1976), Yoshimura (1980a, 1980b, 1982 등), Kito and Hope (1999), Kito and Nakamura (2001) 등에 의해 지금까지 조간대의 저질이나 해조류에 서식하는 총 110종의 해양 선형동물들이 보고되어 있다. 하지만 우리나라의 경우는 동물과 식물에 기생하는 종과 토양에 자유 생활하는 종들에 관해서는 최영연과 그의 제자들에 의해 총 160 종이 보고되어 있어 그나마 상세히 조사되어 있다고 말할 수 있으나 해양선형동물에 관한 분류학적인 연구는 매우 미진하여 이에 대한 연구는 아직 전무한 상황이다.

전 세계적으로 자국의 생물다양성에 관한 관심이 고조된 지금의 현 시점에서 이렇게 다양한 해양선형동물들이 전혀 연구가 되어 있지 않았다는 것은 놀라지 않을 수 없는 현실이다. 또한 다양한 선형동물 종들의 추정치나 잘 연구된 나라의 선형동물 연구사를 볼 때 인접 일본이나 중국 또한 해양 선형동물에 대한 분류학적인 연구가 얼마나 미비하다는 것을 간접적으로 알 수 있으며 앞으로 한국에서의 선형동물 연구에 대한 관심사가 진작될 때 동 아시아에서의 선형동물 연구의 강국이 될 수 있는 큰 가능성을 시사하고 있다고 볼 수 있다.

본 연구의 목적은 이미 상당 부분 채집하여 연구중인 분류군들과 연구 기간 중에 전국 해안의 조간대와 특히 전 세계적으로 아직까지 연구가 미비한 부분인 조하대의 각종 미소 서식지들에서 새로이 채집될 다양한 표본들을 근거로 국내에서는 아직 연구가 부진한 해양 선형동물의 종류상과 분포상을 상세히 밝혀 상대적으로 미진한 상태로 있는 동 아시아지역에서의 해양선형동물에 관한 생물다양성 연구에서 우리나라가 선도적인 지위에 도달할 수 있는 계기가 되는 것을 일차 목표로 하고 있다. 또한 본 연구과제의 수행으로 인해 자세히 밝혀질 해양선형동물을 기반으로 방대한 해양선형동물의 전반적인 연구를 수행할 수 있는 기틀을 마련함에 있다.

또 한가지 본 과제의 중요한 파급 효과로 여겨지는 것은, 이러한 해양선형동물의 일차적인 형태학 연구로 인해 자세히 밝혀질 종류상과 분포상 및 생태학적인 특징들을 이용하여 그간에 성행하였던 환경영향평가(environmental impact assessment)에 있어서 새로운 지침을 마련할 수 있으리라 본다. 그간의 해양에서 수행되었던 환경영향평가에 이용된 대다수의 분류군들은 십각류나 연체류와 같이 사람들의 육안으로 쉽게 인식할 수 있는 상당히 큰 무척추동물들이었다. 하지만 기존의 이들 분류군들은 사람의 눈에 잘 띈다는 점과 나름대로의 장점들을 가지고 있지만 상기에 서술한 해양선형동물들의 많은 장점들을 충분히 활용하면 기존의 환경영향평가에 활용되어온 분류군들에 대비하여 탁월하게 효과적이고도 객관적인 결과를 도출할 수 있으리라 기대한다.
연구 방법
가. 해양선형동물(Nematoda)의 형태분류학적 연구

(1) 문헌자료의 데이터베이스화: 분류학적인 연구뿐만 아니라 모든 연구의 기본이 되는 것은 참고문헌이다. 본 연구과제 신청자는 이미 외국으로부터 출판된 해양 선형동물 관련 논문의 80% 이상을 입수하였고 이를 모두 저자별, 분류군별, 연도별, 국가별, 해역분포별, 서식처별, 주요 분류형질별, 기타 검색어별 등으로 검색할 수 있도록 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 데이터베이스화하였다. 또한 본 연구과제 수행기간 동안 지속적으로 관련 문헌을 입수하고 데이터베이스화하여 원활한 연구를 수행한다.

(2) 조사지점: 한국은 3면(동해, 남해, 서해)이 바다로 이루어져 있고 이들은 각각 다양한 저질로 이루어져 있어 3년간의 연구기간동안 한국의 여러 해역을 광범위하게 조사할 예정이다. 특히 제주도와 같이 한국 고유종을 많이 보유하고 있는 지점을 집중 조사할 예정이다.  

(3) 채집:
a. 조간대: 선형동물의 다양성과 생물량에 관해서는 본 과제 신청자의 지난 4년 동안의 사전 현장조사와 문헌조사를 통해 상당 부분 파악하고 있다. 선형동물은 특히 해안과 저질의 안정성과 연관이 깊은데, 이를 고려하여 조사를 수행할 것이다. 선형동물은 해안의 파도가 치는 지점뿐 아니라 파도가 도달하지 않은 상부의 지점까지 넓게 분포하는데, 이를 위해 물 가장자리와 상부의 저질 표면을 core sampler를 이용하여 넓은 범위에서 긁어모은다. 수직분포 면에서, 대부분의 선형동물은 저질의 상층부 수㎝(1-3㎝) 지점에 집중적으로 분포한다. 하지만 혐기성 환경을 더 선호하는 분류군들을 위해서는 30㎝이하의 지점까지도 조사할 예정이다. 이렇게 모아진 저질들을 뒤섞이지 않게 실험실로 운반하여, 서늘하고 그늘진 곳에서 보관한다. 해양 선형동물은 생존력이 매우 강한데, 본 과제 신청자의 경험에 의하면 실험실내에서 최대 7개월 이상까지 생존하는 것을 보았다. 저질 상층부의 일부분씩 덜어서 sorting한다. 일부 덜어진 모래나 해조류(根徑部포함)의 시료와 동일한 부피의 5% MgCl2를 첨가하여 10분간 마취, bubbling technique 및 decantation 방법을 이용해 모래 및 해조로부터 분리한 뒤 net(그물눈 크기 64㎛)를 통해 3회-5회 반복하여 거른다. 여기에, 걸러진 해수(filtered seawater)를 다량 첨가해 생체 표본으로 이용하거나 여의치 않을 경우 마취시킨 상태에서 약 10% 중성 포르말린 또는 분자실험을 위해 95% 에탄올로 고정한다. 또한 저인망 어선의 자망과 통발에 걸려 나오는 각종 무척추동물들과 해안의 석회조류를 포함한 각종 해조류, 패각 부스러기 등을 양동이에 모으고, 위와 동일한 방법으로 걸러 고정한다.

b. 조하대: 본 연구과제에서 가장 중점적으로 조사되어야 할 부분이다. 앞서 언급한데로 타 외국의 선형동물 연구에 관한 문헌조사를 통해 조하대에 관한 연구는 상당히 빈약함을 알 수 있었다. 본 과제 신청자는 한국내의 사전조사를 통해 조하대에서 한국 고유종이 많이 채집된다는 경험을 바탕으로 동해와 남해의 조하대 조사를 집중적으로 실시할 예정이다. 조하대 채집은 SCUBA 조사로 수심 30m 내외의 다양한 서식지를 대상으로 하는데 직접 조하대의 다양한 저질, 해조류, 기타 무척추동물들을 채집하여 조간대에서와 같은 과정을 거쳐 걸러낸다. 한편, 해양연구원과 같은 타 연구기관에서의 조하대나 심해(deep sea: 수심 5000m 이하) 조사 과정 중에 채니기 (grab)에 걸려 나오는 sample을 일부 제공받는다.

(4) 표본의 추출 (extraction): 해양 선형동물은 크기가 대단히 작고, 몸의 점액질을 이용하여 모래나 부식질에 단단히 붙어 있어 표본제작 하기 전에 채집물로 부터 선형동물을 골라내야만 하는, 번거롭고 고된 작업을 감수해야만 한다. 마취 및 고정과정에서 파열 또는 형태의 뒤틀림이 생기면 표본으로서의 가치가 많이 떨어지게 되므로 생체 표본으로 추출하는 것이 훨씬 용이하고 좋은 표본을 제작하는 결과를 얻을 수 있다. 채집물을 일단 5%정도의 약한 MgCl2나 에탄올로 10분간 마취시켜 Swedmark 기술과 Bubbling 기술 (Hulings and Gray, 1971) 등을 이용하여 모래와 저질로부터 선형동물을 떨어지게 한 후, 마취된 상태로 나일론 천(그물눈 크기 64㎛)에 걸러진 생체 표본을 다시 신선한 해수로 씻어내어 표본을 추출한다. 추출된 표본은 해부현미경(50x-100x) 하에서 micropipette을 사용하여 골라낸 후 70℃ 정도의 뜨거운 물을 생체표본에 부어 코일처럼 꼬이는 현상을 방지하고 5% 중성포르말린으로 고정한다.

(5) 표본제작: 추출된 표본들은 하나의 작은 petridish에 모은다. 모아진 표본들은 현미경 관찰을 위해 표본을 제작하여야 하는데, 이때 에탄올과 glycerine 혼합액(95:5 비율)을 표본들이 담긴 용기에 부어 36℃ 항온기(incubator)에 넣고 약 7일 동안 서서히 탈수시킨다. 순수한 glycerine에 담겨 있는 탈수된 표본을 한 개체씩 mounting medium(glycerin이나 Hoyer solution)을 사용하여 영구 파라핀 슬라이드를 만든다. 만들어진 슬라이드를 H-S slide 틀(flame)에 고정하여 관찰과 동정을 한다. H-S slide는 양쪽 면을 모두 관찰할 수 있는 장점이 있어 종의 올바른 동정에 필수적이다.

(6) 관찰 및 동정: 미소한 해양 선형동물의 표면 구조는 매우 복잡하여 DIC(Differential Interference Contrast)장치를 이용하면 높은 효율성이 있으며, 보통 1,000배 이상의 배율에서 관찰과 동정, 사진촬영 및 도판 작성을 한다. 도판은 drawing tube를 사용하여 보통 1,500배의 배율에서 그린다. 선형동물의 표면, 두부 감각모의 배열, 구강구조 및 생식기 부분 등의 중요 분류형질들을 400배-1,500배로 정밀하게 관찰하면서 관련문헌에 따라 동정한다.

(7) 미세구조 관찰 및 현미경 사진 촬영: 해양 선형동물은 그 크기가 대단히 작음에도 불구하고 외부의 형태가 매우 분화되어 있다(예: 두부 감각모의 배열, 몸 표면의 구조, 구강내의 구조 등). 이의 관찰을 위해서는 위에서 언급한 DIC 현미경을 사용하거나 주사전자현미경을 사용하여야 한다. 주사전자현미경 관찰을 위한 시료의 준비는 우선 표본들을 90℃ 정도의 뜨거운 에탄올로 고정한 뒤, 전고정(prefixation)과 후고정(postfixation)의 단계를 거친 후에 graded alcohol로 탈수(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%: 각각 30분씩), critical point dryer에서의 임계 건조, Ion coater를 이용한 gold coating과정 등을 거쳐 stub 위에 mounting한다. DIC 현미경에서의 관찰 후에 각 종의 중요 형질들을 현미경에 장착된 Digital Camera(Cool-Pix 990)를 이용하여 사진 촬영한다. Digital Camera는 사용이 간편하고 바로 컴퓨터 상에서 편집이 용이하여 도감편찬 및 데이터베이스화 등에 많은 도움이 될 것이다.

(8) 생체 관찰: 선형동물의 생체관찰은 올바른 종의 동정에 매우 중요하다. 따라서, 연구기간 동안 채집될 모든 분류군들에 관하여 되도록 생체관찰을 시도하고 Digital Camera를 이용 사진촬영 하여 기존의 기록종들과 면밀히 비교 분석할 예정이고, Digital Camera로 찍은 사진들을 컴퓨터 상에서 분석하여 향후 도감편찬이나 교육자료를 만드는데 사용할 것이다.

(9) 유생의 형태적 특징 고찰: 해양선형동물의 종들에 관한 사전 연구 조사에서 본 과제 신청자는 각 종의 유생 시기마다, 또는 한 종 내의 유생시기마다 분류학적인 형질들의 변이가 심하다는 것을 관찰하였다. 즉, 이들 선형동물의 유생에서 성체로 성숙하면서 나타나는 연속적인 형태분화에 관하여 면밀히 분석하여 분류학적인 형질로서의 가치를 검토하고 도판과 현미경사진을 제시할 예정이다.

나. 해양 선형동물내의 분자계통분석

(1) 실험재료 준비
우선 분자계통 분석에 필요한 각 분류군별 대상 종을 선정한 다음 전국의 여러 해양 저서무척추동물 조사지점으로부터 대상 종의 시료를 확보한다. 실험 재료로 활용될 표본들은 가급적 살아있는 상태(부득이 할 경우 알코올에 고정)로 실험실에 운반하여 종을 동정하고 total genomic DNA 추출에 이용한다.

(2) Total Genomic DNA 추출
종이 동정된 시료로부터 total genomic DNA의 추출은 대상 동물로부터 total genomic DNA를 DNeasy Tissue kit(Quiagen, Co.)의 조직 샘플 추출 protocol을 이용하여서 뽑은 후 PCR의 template로 사용한다.

(3) PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한  18S rDNA 증폭
후생동물의 계통분류에 널리 이용되고 있는 18S rDNA의 universal primer set [Primer 328 : 5'-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3', Primer 329: 5'-TAA TGA TCC TTC CGC  AGG TT-3')을 이용하여 target fragment를 증폭시키는 데 PCR 반응을 위한 반응혼합물의 조성 및 조건은 다음과 같다.

● PCR Mixture
10 ㎕ 10X Reaction Buffer
[100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.01% Gelatin]
16 ㎕ a mix. of 1.25 mM of each dNTP (dGTP, dCTP, dATP, dTTP)
1 ㎕ of each primer
0.5 ㎕Genomic DNA template
2.5 units of Taq DNA Polymerase

● PCR Condition
Initial denaturation 94℃ 1 min
Denaturation 94℃ 1 min (X 30 cycles)
Primer annealing 52℃ 2 min (X 30 cycles)
Extension 72℃ 3 min (X 30 cycles)
Final extension 72℃ 10 min

PCR 결과 원하는 target gene fragment(18S rDNA 부위)가 증폭되었는 지를 확인하기 위해 반응물을 EtBr이 섞인 1x TAE, 1.0% agarose gel에서 DNA ladder(Promega Co.)와 함께 약 30분간  100V로 전기영동시킨 다음, long-waved UV light 하에서 증폭된 18S 리보솜 DNA band를 확인한다.

(4) 증폭된 DNA fragment의 cloning 방법
PCR에 의해 증폭된 DNA를 PCR purification kit를 이용하여 정제한다(Qiagen Co.). 정제된 PCR product에  pGEM T Easy Vector(Promega Co.)를 이용하여 T-A ligation한 후 새로이 형성된 재조합 DNA(plasmid)를 Ec1으로 setting된 MicroPulser(BIO-RAD Co.)를 이용 electrophoretion 시켜 DH5α competent cell line에 형질전환 시킨다. 형질전환 된 DH5α competent cell을 1시간 정도 37℃에 incubation 한 후 원심분리를 통해 형질전환 된 cell을 모은 다음 이를 50㎕/ml amphicillin이 처리된  agar plate에 spreading 한 후, 37℃ oven에서 overnight incubation한다. 증폭된 리보솜 DNA 부위를 가진 plasmid가 들어간 cell은 amphicilin에 저항성을 가지며 pH의 변화로 인해 white colony를 형성하므로 white colony만을 picking하여 50㎕/ml ampicillin이 섞여 있는 5㎖의 LB(Luria-Bertani) medium에 seeding하여 37℃에서 키운다. 12시간 정도 키운 cell을 취해 OIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen Co.)를 이용하여 insert가 들어가 있는 plasmid DNA를 뽑아 원하는 크기의 insert DNA가 포함된 plasmid를 agarose gel에서 전기영동을 통하여 찾아낸다. 원하는 크기의 plasmid를 적당한 제한효소로 잘라 insert DNA의 크기를 1% agarose gel에서 확인한다. Cloning이 확인된 cell을 더 많은 부피의 LB medium에 키워 많은 양의 plasmid DNA를 얻어 cyclic sequencing reaction의 template로 이용한다.

(5) Cloning된 18S 리보솜 DNA 부위의 염기서열 결정
증폭된 18S rDNA가 삽입된 plasmid를 정제한 후, BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit v. 2.0(PE Biosystems Co.)를 이용하여 cyclic sequencing한다(94℃ 5s, 50℃ 10s, 60℃ 4min; 25 cycles). 18S rDNA는 full sequence가 약 1.8 kb 정도의 길이를 가지고 있으므로 5’과 3’ 양쪽 끝에 있는 primer 이외에 진핵생물에서 널리 이용되고 있는 internal sequencing primer를 이용하여 sequencing reaction을 수행한다. Cyclic sequencing이 끝난 sequencing product는 alcohol precipitation 방법 혹은 Centri-Sep Columns(Princeton Separations Co.)을 이용하여 정제시킨 다음 speed vacuum에서 완전히 건조시킨다. 준비된 시료의 DNA 염기서열 결정을 위해 ABI 3100 automated sequencer를 이용한다.

(6) 계통분석을 위한 data analyses
분자계통 연구 및 분자진화 연구를 위해서는 여러 분류군들로부터 얻어진 염기서열을 alignment할 수 있는 program이 필요하며 이를 위해서 Clustal X program(Thompson et al., 1997) 등을 사용한다. Sequence alignment는 DNA 염기서열을 기초로 한 분자계통연구에서 편중 (biased)되지 않은 객관적인 계통수를 얻는데 있어 가장 중요한 요소 중에 하나이다(Castresana, 2000). 따라서, Clustal X를 이용해 aligned된 sequence file을 최근에 고안된 G-Block(http://www.embl-heidelberg.de/~castresa/Gblocks/Documentation/Gblocks_documentation.html) program을 이용하여 신뢰성 있는 realignment를 수행하고 이를 바탕으로 PAUP 4.0a* 또는 PHYLYP program 등을 이용하여 다양한 계통분석을 실시한다(예: Parsimony analysis, Neighbor Joining Analysis, Maximum Likelihood Analysis, Likelihood Ratio Test, Parametric Bootstrapping 등). 또한 18S rDNA의 염기서열(primary sequence)과는 달리 그들의 2차 구조(secondary structure)는 비교적 유연 관계가 먼 분류군들 사이에도 보존성이 높아 이들의 2차 구조를 비교하여 계통을 추적할 수 있다. 따라서, 필요할 경우 MacDNASIS V 3.0 program(Hitachi Software Engineering Co..)을 이용하여 18S rDNA의 2차 구조를 비교하여 분류군간 계통 유연 관계를 추정한다.
기대효과
가. 형태분류학적인 결과의 파급효과

(1) 종다양성 - 해양선형동물의 엄청난 종 다양성을 고려해 볼 때 다수의 신종을 밝힐 수 있으리라 기대한다. 이런 종 다양성에 관한 연구는 앞으로 동아시아 지역에서의 생물다양성 연구에서 주도적인 위치를 선점할 수 있는 밑거름이 될 수 있을 것이다.

(2) 해양선형동물의 폭 넓은 형태 분류학적인 연구를 통하여, 기존에 종을 구분하는데 사용되었던 형질 이외에도 새롭게 종을 구분하고 상위 분류군을 grouping하는데 유용한 형태학적인 형질을 발견할 수 있으리라 기대한다. 기존의 형질에 대한 분석뿐만 아니라 새로운 형질의 개발은 선형동물의 분류체계를 확립하는데 매우 중요한 사항이다.

(3) 해산선형동물에 대한 분류학적 연구(형태연구 및 분자계통 연구분야)를 수행함으로써 생물다양성 연구에 필수적인 차세대 분류학자를 양성하고 순수기초과학분야 발전을 위한 인프라구축에 기여한다.

(4) 생물지표종(bioindicator) - 해양 선형동물의 생물량과 종 다양성은 해양생태계의 먹이연쇄에서 매우 중요한 역할을 하고 있으므로 한국내의 해양 선형동물에 대한 분류학적인 명세가 자세히 밝혀지면 이후 이들을 생물지표종으로 이용하여 해양 환경변화 및 오염성 정도를 탐침할 수 있는 생태 모니터링(monitoring)의 기초자료로서 이용될 수 있다.

(5) 도감 제작 - 다수의 종을 대상으로 한 여러 종류의 참고도서와 백과사전을 편찬하는데 활용될 것이다.

(6) 종 다양성 은행 구축 - 조사된 다양한 분류군에 대한 형태학적인 기재와 생태학적인 특징들에 대하여 여러 가지 소프트웨어를 이용하여 데이터베이스화 하면 선형동물을 필요로 하는 다른 여러 연구분야에서 충분히 활용될 수 있을 것이다. 이의 좋은 예로는 유전학과 발생학 등의 타 분야에서 많이 활용되고 있는 예쁜꼬마선충(Caenorhaditis elegans)을 들 수 있다.

나. 분자계통분류학적인 결과의 파급효과

(1) 분류체계의 확립 및 다양성의 이해 - 형태분류학을 통해 얻은 분류체계와 함께 다양한 분자 마커를 이용한 분자계통분류학적인 분석결과를 종합적으로 비교하여 선형동물의 실질적인 분류체계를 확립하고 그들의 다양성 및 진화방향을 이해하는데 필수적인 정보를 제공할 것이다.

(2) 계통 유연관계 검증 - 18S rDNA, Hox 유전자, ß-thymosin 단백질, 및 핵단백질의 정렬(nuclear protein alignmets)분석 등의 기존의 연구 결과들과 함께 다양한 분류군들에 대한 mtDNA 전체염기서열을 비교, 분석함으로써 탈피동물들 사이의 계통 유연관계 및 다양성을 이해할 수 있는 정보를 제공할 것이다.

(3) 유전자 은행 구축 - 본 연구과제의 수행으로 얻어질 다양한 선형동물에 관한 유전자 분석과 기타 탈피동물군(유선형동물, 절지동물, 복모동물, 동문동물 등)에 대한 mtDNA 전 genome분석을 통해 유전자 은행 구축의 밑거름이 될 것이다.

(4) 해산 선형동물에 대한 형태 분류학적 연구 및 분자계통 연구분야를 동시에 수행함으로써 전통분류학적 지식과 현대 분류학적 기술을 조화시킬 수 있는 차세대 분류학자를 양성하고 이를 통해 순수기초과학분야 발전을 위한 인프라구축에 기여한다.